mRNA疫苗

mRNA疫苗打破了傳統(tǒng)滅活、減毒疫苗的免疫激活模式，創(chuàng)新性地利用人體本身細(xì)胞生產(chǎn)抗原，以此激活特異性免疫。mRNA疫苗的保護(hù)率極高，能達(dá)到90%。在研發(fā)上，mRNA疫苗能夠快速地更新迭代以應(yīng)對(duì)不斷出現(xiàn)的變異毒株，且生產(chǎn)過(guò)程短，只需要60-70天。對(duì)于新型冠狀病毒疫苗的研制，除了抗原設(shè)計(jì)外，選擇合適的載體也是至關(guān)重要的。在疫情影響下，mRNA 疫苗讓科研人員愈發(fā)重視，關(guān)于它的各項(xiàng)研究正在如火如荼地進(jìn)行中。

爭(zhēng)分奪秒|賽默飛全流程助力mRNA COVID-19疫苗研發(fā)

核酸疫苗-mRNA關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQA

通過(guò)工藝開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行描述：為了使疫苗能被監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受，需要對(duì)純度/雜質(zhì)監(jiān)測(cè)(CQAs)進(jìn)行深入的分析表征和確定的標(biāo)準(zhǔn)，以確保安全性和有效性。這意味著雜質(zhì)需要通過(guò)表征來(lái)理解，定義可接受的水平，然后監(jiān)測(cè)安全性和有效性。

行業(yè)領(lǐng)先的mRNA解決方案-加速賦能實(shí)現(xiàn)企業(yè)關(guān)鍵性進(jìn)展

課程一：理想中的二維液相色譜系統(tǒng)——疫苗研究的創(chuàng)新

課程一：理想中的二維液相色譜系統(tǒng)——疫苗研究的創(chuàng)新

Alexander Schwenger 是德國(guó) CureVac AG 的 EPD物理化學(xué)經(jīng)理。 他在斯圖加特大學(xué)獲得博士學(xué)位。

Frank Steiner 賽默飛產(chǎn)品應(yīng)用高級(jí)經(jīng)理，HPLC 科學(xué)顧問(wèn)

課程概要：
了解如何使用二維液相色譜 (2D-LC) 克服疫苗研究中當(dāng)前和未來(lái)的挑戰(zhàn)。 本次網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)將概述幾種 2D-LC 設(shè)置，并展示如何通過(guò)創(chuàng)新解決方案幫助加快研究項(xiàng)目。 新時(shí)代科學(xué)需要量身定制的解決方案——了解我們?nèi)绾芜M(jìn)行個(gè)性化疫苗開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。|
聆聽(tīng)和學(xué)習(xí) CureVac 的 Alexander Schwenger 博士和 Thermo Fisher Scientific 的 Frank Steiner 博士討論二維液相色譜和創(chuàng)新用例的亮點(diǎn)。

課程二：液相色譜新技術(shù)在核酸疫苗研發(fā)中的應(yīng)用-提純

課程二：液相色譜新技術(shù)在核酸疫苗研發(fā)中的應(yīng)用-提純

劉曉達(dá) 博士 賽默飛世爾科技應(yīng)用中心 應(yīng)用顧問(wèn)

本講座介紹HPLC在核酸疫苗研發(fā)到質(zhì)控中的產(chǎn)品表征，如雜質(zhì)分析和驗(yàn)證同一性的核酸譜分析，病毒載體聚集體雜質(zhì)分析，脂質(zhì)體LNP輔料分析、方法學(xué)驗(yàn)證等。對(duì)mRNA體外轉(zhuǎn)錄放大純化、RNA的制備純化脫鹽等應(yīng)用都做介紹。

課程三：液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)在 mRNA 疫苗表征及質(zhì)控中的應(yīng)用

課程三：液質(zhì)聯(lián)用平臺(tái)在 mRNA 疫苗表征及質(zhì)控中的應(yīng)用

漆倩 賽默飛世爾科技高分辨質(zhì)譜團(tuán)隊(duì) 應(yīng)用工程師

講座將分享液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于mRNA疫苗表征及質(zhì)控，包括加帽效率檢測(cè)、polyA尾長(zhǎng)度表征、DNA模板及探針等雜質(zhì)檢測(cè)、HCPs宿主殘留蛋白表征，及mRNA mapping序列確證。

課程四：使用自動(dòng)LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物

課程四：使用自動(dòng)LC-MS工作流程表征mRNA治療藥物

馬克·迪克曼 （Mark Dickman）教授 謝菲爾德大學(xué)化學(xué)與生物工程系

講座將詳細(xì)講解mRNA技術(shù)在快速疫苗開(kāi)發(fā)方面的潛力，并提出針對(duì) mRNA的LCMS/MS 分析方法優(yōu)化。

課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS

課程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS

Ken Cook，Ph.D. Thermo Fisher Scientific EU BioPharma Expert

?  mRNA序列測(cè)定的挑戰(zhàn)
?  得到正確的mRNA序列的Tips
?  Smart Digest RNase T1 Mag Bulk 酶切mRNA實(shí)例分享

課程六：液相色譜耗材技術(shù)在基因治療和預(yù)防藥物中的表征

課程六：液相色譜耗材技術(shù)在基因治療和預(yù)防藥物中的表征

史俊霞 賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司 高級(jí)產(chǎn)品專(zhuān)家

?  基因治療藥物的概況和藥物生產(chǎn)考慮的關(guān)鍵因素
?  核苷和寡核苷酸藥物生產(chǎn)中色譜分析案例分享
?  核酸藥物生產(chǎn)中色譜分析案例分享
?  藥物載體的表征

只需30秒簡(jiǎn)單注冊(cè)，即可解鎖上述所有mRNA課程。

目前獲批上市的疫苗佐劑多數(shù)集中在微小顆?；蚣{米顆粒，包括鋁鹽、乳劑、脂質(zhì)體和病毒載體。

脂質(zhì)體主要由磷酸類(lèi)脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子夾水結(jié)構(gòu)，可包裹多種疫苗，并有效地將抗原送至細(xì)胞對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。其作用機(jī)制與鋁佐劑相似，具有儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)，并可以增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞（APC）對(duì)抗原的攝入。
由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒(méi)有紫外吸收，CAD電霧式檢測(cè)器較傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器、ELSD檢測(cè)器等有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，分析物既不需要發(fā)色團(tuán)也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測(cè)。

CAD檢測(cè)器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現(xiàn)性成為新冠mRNA疫苗質(zhì)量控制的首選。本實(shí)驗(yàn)利用Vanquish Flex液相色譜系統(tǒng)和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測(cè)器來(lái)分析疫苗中的佐劑。

儀器配置：

Vanquish Flex系列
泵：Binary Pump F  VF-P10-A（S/N：8306835）
自動(dòng)進(jìn)樣器：Split Sampler FT  VF-A10-A（S/N：1004811）
柱溫箱：Column Compartment H  VH-C10-A（S/N：6300969）
檢測(cè)器：Charged Aerosol Detector H（S/N：8318615）

色譜條件：

分析柱：Acclaim 300 C18 150×2.1mm，3.0um (PN:060264 )
柱    溫： 50℃（配主動(dòng)預(yù)熱）
CAD檢測(cè)器：過(guò)濾常數(shù)：3.6s，霧化溫度：50℃，采集頻率：5Hz
流速=0.4mLl/min
進(jìn)樣量： 10μL

色譜圖：


系統(tǒng)適用性色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論:

PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2 >0.999。 本方法五種組分檢測(cè)限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。


定量限色譜圖

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本方法利用CAD電霧式檢測(cè)器直接檢測(cè)疫苗中的脂質(zhì)體載體，無(wú)需進(jìn)行前處理，靈敏度高，分離度和重復(fù)性好。

樣品前處理簡(jiǎn)單，樣品經(jīng)純化水稀釋后可直接進(jìn)樣分析。


制劑樣品色譜圖

賽默飛“疫苗研發(fā)與工藝質(zhì)量控制”解決方案

疫苗是指用各類(lèi)病原微生物制作的用于預(yù)防接種的生物制品。疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其 代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。疫苗保留了病原菌刺激動(dòng)物 體免疫系統(tǒng)的特性。當(dāng)動(dòng)物體接觸到這種不具傷害力的病原菌后，免疫系統(tǒng)便會(huì)產(chǎn)生一定的保護(hù)物質(zhì)，如免疫激素、活性 生理物質(zhì)、特殊抗體等。

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新冠疫苗主流研發(fā)工藝

1. 前處理

Nuclease T1是一種真菌核酸內(nèi)切酶，可切割鳥(niǎo)嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強(qiáng)的特異性，常用于核酸測(cè)序應(yīng)用。但由于核酸內(nèi)切酶效率很高，酶解時(shí)間較難控制，且傳統(tǒng)的溶液酶解方法會(huì)使核酸酶殘留在分析柱上造成污染。基于以上需求，賽默飛推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過(guò)簡(jiǎn)單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時(shí)間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性并降低酶的干擾（如下圖）。

 

有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過(guò)磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應(yīng)；b) 采用全自動(dòng)磁珠純化儀，反應(yīng)、分離及純化均可根據(jù)設(shè)置好的程序進(jìn)行自動(dòng)操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。


圖a:手動(dòng)前處理示意圖


圖b: 全自動(dòng)化在線前處理示意圖

反應(yīng)條件的優(yōu)化：

a. 反應(yīng)時(shí)間：酶解時(shí)間控制在5min 內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對(duì)于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應(yīng)時(shí)間至30min.
b. 反應(yīng)溫度：37℃與50℃的結(jié)果類(lèi)似

2. 色譜柱

色譜分離采用一款專(zhuān)用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹(shù)脂構(gòu)成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對(duì)寡核苷酸可實(shí)現(xiàn)高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類(lèi)型號(hào)，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號(hào)。

圖 A


圖 B

3. 液相系統(tǒng)

核酸樣品吸附性強(qiáng)，而生物惰性液相系統(tǒng)吸附低；其次離子對(duì)試劑易腐蝕液相系統(tǒng)管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統(tǒng)。

液相方法如下圖：

4. 質(zhì)譜

新一代Orbitrap Exploris系列產(chǎn)品具有體積小、性能高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)展了Q Exactive系列質(zhì)譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內(nèi)置的AcquireX數(shù)據(jù)采集工作流程，為各種不同類(lèi)型的應(yīng)用設(shè)置參數(shù)模板，一鍵調(diào)用，可進(jìn)行全面自動(dòng)化的樣品分析；且?guī)в蠩ASY IC離子源內(nèi)標(biāo)校正，保證儀器的高質(zhì)量精度；更快的掃描模式可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級(jí)采用120，000分辨率，二級(jí)30，000分辨率；負(fù)離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 (優(yōu)化后的能量，適用于mRNA mapping). 該方法模板可一鍵調(diào)用，操作簡(jiǎn)便，且得到高質(zhì)量的譜圖。

5. 數(shù)據(jù)分析軟件

Biopharma Finder軟件可實(shí)現(xiàn)核酸樣品自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡(jiǎn)便；對(duì)二級(jí)譜圖進(jìn)行自動(dòng)化注釋和解析；寡核苷酸雜質(zhì)定性和相對(duì)定量分析；多批次樣品含量變化趨勢(shì)比對(duì)。圖b 展示定結(jié)果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對(duì)應(yīng)的理論及實(shí)測(cè)二級(jí)圖譜，將圖譜里響應(yīng)很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結(jié)果可信度高。


圖 a


圖 b

Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎(chǔ)上增加了長(zhǎng)鏈mRNA mapping的功能，在數(shù)據(jù)處理方法中增加核酸酶模塊，有常見(jiàn)的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結(jié)果，對(duì)于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細(xì)信息，如在序列中的位置、一級(jí)和二級(jí)譜圖、可信度、定量信息等。對(duì)于長(zhǎng)度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNAse T1酶解，即可獲得98.5%序列覆蓋度結(jié)果。

得益于Orbitrap儀器采集的高質(zhì)量圖譜，在核酸分析結(jié)果里幾乎每一條鏈都可實(shí)現(xiàn)100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對(duì)于區(qū)分同分異構(gòu)體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個(gè)特定堿基構(gòu)成，在其酶解片段中出現(xiàn)同分異構(gòu)是常見(jiàn)的現(xiàn)象，如下圖，當(dāng)儀器檢測(cè)到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構(gòu)的兩條鏈里的每一個(gè)堿基，即可輕松區(qū)分兩條分子量相同，序列不同的片段。

對(duì)于長(zhǎng)鏈RNA片段，如下圖具有13個(gè)漏切位點(diǎn)，48個(gè)堿基長(zhǎng)度的片段，也可鑒定到每一個(gè)堿基，得到高可信度結(jié)果。酶解片段越長(zhǎng)，其序列特異性越強(qiáng)，對(duì)于RNaes T1酶解無(wú)法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長(zhǎng)片段作為互補(bǔ)信息。

案例分享：

編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對(duì)色譜檢測(cè)mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺(tái)，從前處理到液質(zhì)表征分析，得到如下結(jié)果：圖b顯示mRNA樣品經(jīng)過(guò)RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長(zhǎng)，具有高特異性；與理論堿基序列匹配，在嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選條件下，可得到98.5%的序列覆蓋度。


圖 a


圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1


圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA

基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜核酸分析平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質(zhì)鑒定及定量等功能，為疫苗開(kāi)發(fā)和質(zhì)控提供更精確可靠的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
[1]  Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)

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講座將分享液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于mRNA疫苗表征及質(zhì)控，包括加帽效率檢測(cè)、polyA尾長(zhǎng)度表征、DNA模板及探針等雜質(zhì)檢測(cè)、HCPs宿主殘留蛋白表征，及mRNA mapping序列確證。

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目前獲批上市的疫苗佐劑多數(shù)集中在微小顆?；蚣{米顆粒，包括鋁鹽、乳劑、脂質(zhì)體和病毒載體。

脂質(zhì)體主要由磷酸類(lèi)脂、膽固醇、硬脂胺等組成的單層或多層雙分子夾水結(jié)構(gòu)，可包裹多種疫苗，并有效地將抗原送至細(xì)胞對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。其作用機(jī)制與鋁佐劑相似，具有儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)，并可以增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞（APC）對(duì)抗原的攝入。
由上述介紹可以看出，大部分佐劑都沒(méi)有紫外吸收，CAD電霧式檢測(cè)器較傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器、ELSD檢測(cè)器等有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，分析物既不需要發(fā)色團(tuán)也不需要離子化，適用于不揮發(fā)及半揮發(fā)化合物的高靈敏度檢測(cè)。

CAD檢測(cè)器有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重現(xiàn)性成為新冠mRNA疫苗質(zhì)量控制的首選。本實(shí)驗(yàn)利用Vanquish Flex液相色譜系統(tǒng)和Charged Aerosol Detector H電霧式檢測(cè)器來(lái)分析疫苗中的佐劑。

儀器配置：

Vanquish Flex系列
泵：Binary Pump F  VF-P10-A（S/N：8306835）
自動(dòng)進(jìn)樣器：Split Sampler FT  VF-A10-A（S/N：1004811）
柱溫箱：Column Compartment H  VH-C10-A（S/N：6300969）
檢測(cè)器：Charged Aerosol Detector H（S/N：8318615）

色譜條件：

分析柱：Acclaim 300 C18 150×2.1mm，3.0um (PN:060264 )
柱    溫： 50℃（配主動(dòng)預(yù)熱）
CAD檢測(cè)器：過(guò)濾常數(shù)：3.6s，霧化溫度：50℃，采集頻率：5Hz
流速=0.4mLl/min
進(jìn)樣量： 10μL

色譜圖：


系統(tǒng)適用性色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論:

PEG(聚乙二醇)、Chol(膽固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)以及兩種自制佐劑在0.25 μg/ml～50 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2 >0.999。 本方法五種組分檢測(cè)限為0.125 ppm(S/N=3)，定量限為0.25 ppm(S/N=10)。


定量限色譜圖

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本方法利用CAD電霧式檢測(cè)器直接檢測(cè)疫苗中的脂質(zhì)體載體，無(wú)需進(jìn)行前處理，靈敏度高，分離度和重復(fù)性好。

樣品前處理簡(jiǎn)單，樣品經(jīng)純化水稀釋后可直接進(jìn)樣分析。


制劑樣品色譜圖

賽默飛“疫苗研發(fā)與工藝質(zhì)量控制”解決方案

疫苗是指用各類(lèi)病原微生物制作的用于預(yù)防接種的生物制品。疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其 代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。疫苗保留了病原菌刺激動(dòng)物 體免疫系統(tǒng)的特性。當(dāng)動(dòng)物體接觸到這種不具傷害力的病原菌后，免疫系統(tǒng)便會(huì)產(chǎn)生一定的保護(hù)物質(zhì)，如免疫激素、活性 生理物質(zhì)、特殊抗體等。

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新冠疫苗主流研發(fā)工藝

1. 前處理

Nuclease T1是一種真菌核酸內(nèi)切酶，可切割鳥(niǎo)嘌呤殘基后的單鏈RNA，具有較強(qiáng)的特異性，常用于核酸測(cè)序應(yīng)用。但由于核酸內(nèi)切酶效率很高，酶解時(shí)間較難控制，且傳統(tǒng)的溶液酶解方法會(huì)使核酸酶殘留在分析柱上造成污染。基于以上需求，賽默飛推出了一款前處理磁珠，將Nuclease T1酶固定在磁珠上，通過(guò)簡(jiǎn)單快速的磁鐵吸附及可有效控制酶解時(shí)間，并去除溶液里的T1酶，該方式可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性并降低酶的干擾（如下圖）。

 

有離線及在線兩種方式可供選擇：a) 將樣品配成200 μL體積放于eppendorf管中（如下圖a所示），置于酶解儀中震蕩孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通過(guò)磁鐵吸附的方式將酶解上清與磁珠分離，再加入1%甲酸終止反應(yīng)；b) 采用全自動(dòng)磁珠純化儀，反應(yīng)、分離及純化均可根據(jù)設(shè)置好的程序進(jìn)行自動(dòng)操作，適用于高通量前處理需求（圖b）。


圖a:手動(dòng)前處理示意圖


圖b: 全自動(dòng)化在線前處理示意圖

反應(yīng)條件的優(yōu)化：

a. 反應(yīng)時(shí)間：酶解時(shí)間控制在5min 內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆蓋度明顯降低。對(duì)于修飾mRNA（如甲基化修飾），需要增加反應(yīng)時(shí)間至30min.
b. 反應(yīng)溫度：37℃與50℃的結(jié)果類(lèi)似

2. 色譜柱

色譜分離采用一款專(zhuān)用于核酸分析的色譜柱，Thermo Scientific? DNAPac? RP，該色譜柱由球形寬孔徑 4 μm 聚合樹(shù)脂構(gòu)成，可耐受極端 pH (0-14) 和溫度 (5-110°C) 條件，在HPLC 和UHPLC儀器上均可使用，針對(duì)寡核苷酸可實(shí)現(xiàn)高分辨率和高通量，較小和極大的核酸鏈均可分辨(如下圖A)。圖B顯示DNAPac? RP色譜柱的各類(lèi)型號(hào)，mRNA mapping建議選用2.1*100 mm型號(hào)。

圖 A


圖 B

3. 液相系統(tǒng)

核酸樣品吸附性強(qiáng)，而生物惰性液相系統(tǒng)吸附低；其次離子對(duì)試劑易腐蝕液相系統(tǒng)管路及接口，因此建議使用生物兼容的Vanquish UHPLC系統(tǒng)。

液相方法如下圖：

4. 質(zhì)譜

新一代Orbitrap Exploris系列產(chǎn)品具有體積小、性能高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)展了Q Exactive系列質(zhì)譜儀器的分析能力。如下圖a所示，內(nèi)置的AcquireX數(shù)據(jù)采集工作流程，為各種不同類(lèi)型的應(yīng)用設(shè)置參數(shù)模板，一鍵調(diào)用，可進(jìn)行全面自動(dòng)化的樣品分析；且?guī)в蠩ASY IC離子源內(nèi)標(biāo)校正，保證儀器的高質(zhì)量精度；更快的掃描模式可提高樣品分析通量。圖b顯示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一級(jí)采用120，000分辨率，二級(jí)30，000分辨率；負(fù)離子掃描模式；stepped NCE 25,28,31 (優(yōu)化后的能量，適用于mRNA mapping). 該方法模板可一鍵調(diào)用，操作簡(jiǎn)便，且得到高質(zhì)量的譜圖。

5. 數(shù)據(jù)分析軟件

Biopharma Finder軟件可實(shí)現(xiàn)核酸樣品自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析，如下圖a所示，軟件支持DNA及RNA樣品序列管理，可自定義核酸骨架和可變修飾，操作簡(jiǎn)便；對(duì)二級(jí)譜圖進(jìn)行自動(dòng)化注釋和解析；寡核苷酸雜質(zhì)定性和相對(duì)定量分析；多批次樣品含量變化趨勢(shì)比對(duì)。圖b 展示定結(jié)果圖表，列表里的每一行代表一條鑒定的核酸鏈，右上方對(duì)應(yīng)的理論及實(shí)測(cè)二級(jí)圖譜，將圖譜里響應(yīng)很低的峰放大，可以清楚的看到碎片離子的同位素峰，結(jié)果可信度高。


圖 a


圖 b

Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基礎(chǔ)上增加了長(zhǎng)鏈mRNA mapping的功能，在數(shù)據(jù)處理方法中增加核酸酶模塊，有常見(jiàn)的幾種酶供選擇，也可自定義添加酶。下圖展示mapping分析結(jié)果，對(duì)于mRNA樣品中每一條確證序列的片段，均可溯源詳細(xì)信息，如在序列中的位置、一級(jí)和二級(jí)譜圖、可信度、定量信息等。對(duì)于長(zhǎng)度3900nt的mRNA樣品，在該分析流程下，僅用RNAse T1酶解，即可獲得98.5%序列覆蓋度結(jié)果。

得益于Orbitrap儀器采集的高質(zhì)量圖譜，在核酸分析結(jié)果里幾乎每一條鏈都可實(shí)現(xiàn)100%序列覆蓋（Average Structural Resolution=1.0），這對(duì)于區(qū)分同分異構(gòu)體非常有幫助。前面我們提到mRNA由4個(gè)特定堿基構(gòu)成，在其酶解片段中出現(xiàn)同分異構(gòu)是常見(jiàn)的現(xiàn)象，如下圖，當(dāng)儀器檢測(cè)到足夠多的碎片離子，可以確證同分異構(gòu)的兩條鏈里的每一個(gè)堿基，即可輕松區(qū)分兩條分子量相同，序列不同的片段。

對(duì)于長(zhǎng)鏈RNA片段，如下圖具有13個(gè)漏切位點(diǎn)，48個(gè)堿基長(zhǎng)度的片段，也可鑒定到每一個(gè)堿基，得到高可信度結(jié)果。酶解片段越長(zhǎng)，其序列特異性越強(qiáng)，對(duì)于RNaes T1酶解無(wú)法覆蓋的短片段，也可采用mazF酶解得到的更長(zhǎng)片段作為互補(bǔ)信息。

案例分享：

編碼新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)樣品分析，首先用反相離子對(duì)色譜檢測(cè)mRNA樣品純度，如下圖a所示。采用上述mRNA mapping分析平臺(tái)，從前處理到液質(zhì)表征分析，得到如下結(jié)果：圖b顯示mRNA樣品經(jīng)過(guò)RNase T1酶解后的總離子流圖，由于部分酶解，得到的片段較長(zhǎng)，具有高特異性；與理論堿基序列匹配，在嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選條件下，可得到98.5%的序列覆蓋度。


圖 a


圖 b: Spike Protein mRNA digested with T1


圖 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA

基于Orbitrap高分辨質(zhì)譜核酸分析平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、雜質(zhì)鑒定及定量等功能，為疫苗開(kāi)發(fā)和質(zhì)控提供更精確可靠的數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
[1]  Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500?8506 (2019)

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